HIV相关脑病患者中枢神经系统来源的HIV

冰上超声破碎，4 ℃，9 000×g离心30 min收集上清，蛋白纯化仪进行纯化。按照产品说明书处理镍亲和层析柱后上样，用含10mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L咪唑的Tris-NaCl溶液洗脱，根据吸收峰的位置，收集洗脱液并经SDS-PAGE和WB鉴定。蛋白纯度高的洗脱液经超滤离心管浓缩，再经Column Superdex 75Increase 10/300 GL进一步纯化，洗脱液为含1 mmol/L EDTA的Tris-NaCl，SDS-PAGE和WB进行鉴定，浓缩后BCA试剂盒进行蛋白定量。

1.2.4　Tat蛋白对内皮细胞活性的影响：

HUVECs常规培养，待细胞铺满至90%时，将Tat蛋白加入96孔板中，浓度依次为100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml，每个浓度设5个平行孔，以正常细胞为阴性对照，培养基作为空白对照。36 h后，按cck-8产品说明书操作检测细胞活性，酶标仪450 nm检测吸光度(A)。

1.3　统计学方法：

用SPSS 16.0软件对数据进行统计学处理，各组吸光度值(A)符合正态分布，用均数±标准差(±s)描述，吸光度(A)的检验采用方差分析(α＝0.05)。

二、结果

2.1　HIV-1 Tat原核表达载体的构建　PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在250 bp处出现与预计的tat第一外显子基因(216 bp)片段大小相符的条带。重组质粒pET-32a-tat转化后的阳性菌经PCR鉴定和测序证实为HIV-1 tat基因。

2.2　HIV-1 Tat在原核细胞中的表达、纯化与鉴定WB结果显示，重组质粒pET-32a-tat转化BL21(DE3)后，经IPTG诱导后在相对分子质量15×103处有一条明显蛋白条带(见图1箭头所示)，与目的蛋白大小一致，还有小部分蛋白以多聚体存在，大部分可溶性蛋白在上清中，还有较少部分在包涵体内。上清经镍亲和层析柱纯化，500 mmol/L洗脱液中Tat蛋白含量较高，加入DTT后对蛋白多聚体影响较小(见图2所示)。该峰洗脱液浓缩后经Column Superdex 75 Increase10/300 GL进一步纯化可见单个吸收峰，根据出峰位置可知为一分子量较大的多聚体，纯化浓缩后的Tat蛋白在DTT作用下，分解成以单体为主的多种形式(见图3)。该单峰洗脱液浓缩，测得浓度为0.47 mg/ml。

A：SDS-PAGE；B：Western blot M：Protein marker；1：细菌对照；2: pET-32a载体对照；3: pET-32a-tat全菌；4：上清；5：沉淀

A: SDS-PAGE；B：Western blot M：Protein marker；1：Bacterium control；2：pET-32a plasmid control；3：pET-32a-tat positive bacterium；4：Supernatant；5：Precipitation

图1 HIV-1 Tat的表达与鉴定

Fig.1 Expression and identification of HIV-1 Tat

A：AKTA explorer UV吸收图；B：SDS-PAGE；C：Western blot M：蛋白质分子量标准；1：流穿液；2：流穿液(DTT处理)；3：200 mmol/L咪唑洗脱液；4：200 mmol/L咪唑洗脱液(DTT处理)；5：500 mmol/L咪唑洗脱液；6：500 mmol/L咪唑洗脱液(DTT处理)

A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blot M：protein marker；1：Waste liquor；2：Waste liquor with DTT；3：200 mmol/L imidazole eluent；4：200 mmol/L imidazole eluent with DTT；5：500 mmol/L imidazole eluent；6：500 mmol/L imidazole eluent with DTT

图2 HIV-1 Tat经镍亲和层析柱纯化和鉴定

Fig.2 Purification of HIV-1 Tat protein by Ni-chelatingchromatography column and identification

A：AKTA explorer　UV吸收图；B：SDS-PAGE；C：Western blot；

A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blot；

图3 Column Superdex 75 Increase 10/300 GL　纯化的HIV-1 Tat及鉴定

Fig.3 Purification of HIV-1 Tat by Column Superdex 75 Increase 10/300GL and determination

2.3　Tat蛋白对HUVECs活性的影响　HUVECs吸光度A检测结果及统计学分析见表1和表2。结果显示，不同浓度Tat蛋白的实验组中，HUVECs细胞的A均数在组间的差异具有统计学意义(P0.05)；与阴性对照组相比，300 ng/ml、400 ng/ml、500ng/ml和1 000 ng/ml组A显著降低，差异有统计学意义(P